Перспективы в лечении дегенеративных заболеваний сетчатки

Перспективы регенерации клеток сетчаткиМногие заболевания глаза, приводящие к потере зрения, такие как пигментный ретинит, отслойка сетчатки, связанная с возрастом макулярная дистрофия, заболевания сетчатки при диабете и глаукоме сопровождаются гибелью нейронов сетчатки. Для того чтобы научиться лечить эти и другие заболевания сетчатки необходимо, в частности, выявить клеточные источники регенерации и найти способы их стимулировать.

У взрослых млекопитающих поврежденная сетчатка, как и другие отделы ЦНС, не регенерирует, а погибшие клетки не могут быть замещены образующимися denovo. Это связано с потерей способности ретинальных клеток взрослых млекопитающих к пролиферации и жестко стабилизированной дифференцировкой нейронов сетчатки. Тем не менее, это не означает, что эта ткань не располагает скрытыми внутренними клеточными источниками и механизмами для восстановления. Последние годы характеризуются наиболее активным поиском этого ресурса, локализующегося как внутри самой сетчатки, так и вне ее, но в пределах глаза.

Способность восстановления сетчатки in vivo за счет клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) обнаружена у многих животных в эмбриональном и личиночном состоянии еще в 1983. У взрослых животных такие примеры - исключение. Наивысшей способностью к регенерации сетчатки обладает РПЭ взрослых тритонов . В основе регенерации сетчатки у этих животных лежит активно изучаемый на протяжении многих лет в лаборатории проблем регенерации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития процесс трансдифференцировки клеток РПЭ в нейроны и глиальные клетки сетчатки. У взрослых млекопитающих, в частности крыс, РПЭ не проявляет способности к замещению погибших клеток сетчатки ни в одной из известных моделей ее повреждения. Тем не менее, в 2005 году было показано, что у птиц и млекопитающих клетки РПЭ и пигментированный эпителий цилиарного тела в условиях in vitro также способны проявлять некоторые свойства малодифференцированных клеток-предшественников.

При культивировании клеток РПЭ человека также была показана экспрессия пан-нейральных маркерных белков на фоне подавления исходных характеристик РПЭ. Также известно, что в условиях отслойки сетчатки у млекопитающих происходит инициация пролиферации отдельных ее клеточных типов. Так исследование включения 3Н-тимидина в отслоенной сетчатке кошки показало возможность синтеза ДНК для всех не нейральных клетках: макроглиальных клетках Мюллера, астроцитах, микроглиальных клетках и макрофагах сетчатки, а также в эндотелиальных клетках хороида (Fisher et al., 1991).

Для выявления восстановительных способностей сетчатки низших позвоночных модель отслойки сетчатки применяется редко. В немногочисленных работах исследована сборка и слущивание фоторецепторных дисков в зависимости от аппозиции сетчатки и РПЭ у Xenopus laevis, а также изменения глутаматэргической системы при отслойке сетчатки саламандры. Пролиферативной активности клеток сетчатки в условиях разобщения с РПЭ посвящена только одна работа, выполненная in vitro на тканях глаза эмбрионов шпорцевой лягушки, для решения вопроса о влиянии РПЭ на выход клеток сетчатки из пролиферативной фазы (Stiemke, Hollyfield, 1995).

В последние годы микрохирургическая отслойка сетчатки у тритонов оказалась удобной моделью in vivo для выявления обладающих потенциями к пролиферации клеток сетчатки у Urodela. Опыты с полной отслойкой сетчатки у тритона PI. waltl. показали, что у этих животных она остается жизнеспособной на всех сроках наблюдения (около двух месяцев). В результате Н-тимидиновой импульсной радиоавтографии на полутонких серийных срезах в разные сроки после отслойки удавалось выявить несколько типов клеток, включающих меченый предшественник синтеза ДНК. В S-фазе были обнаружены клетки ростовой зоны глаза, макро- и микроглии, а также отдельные клетки витреального ряда слоя интернейронов. Поскольку число обнаруженных в этом исследовании ДНК-синтезирующих клеток было невелико, работа нуждалась в дополнительных экспериментах с применением иных маркеров синтеза ДНК и использованием длительной непрерывной доставки предшественника.

В сетчатке глаза взрослых крыс также были идентифицированы клетки, способные к пролиферации и фенотипическим модуляциям. Исследования in vivo при повреждении с помощью нейротоксинов показали, что роль потенциального источника для регенерации может принадлежать клеткам Мюллера. Они входят в пролиферативную фазу, дедифференцируются, коэкспрессируют маркерный белок прогениторных клеток - нестин, и специфический белок глиальных клеток - GFAP, а затем, в определенных условиях, белки фоторецепторов и биполяров. Последнее и стало свидетельством продукции глиальными клетками Мюллера в зрелой сетчатке немногочисленных нейронов de novo.

В 2007 г. было также показано, что in vitro клетки Мюллера склонны к образованию сфероидов, где экспрессируются специфический для глиальных клеток ретинальальдегид (CRALBP), связывающий белок, GFAP и нестин. Несмотря на эти и другие находки в области исследования скрытых регенераторных возможностей сетчатки взрослых позвоночных и человека, эта работа еще далека от завершения. В частности, в данном аспекте не проводилось сравнение сетчаток низших и высших позвоночных, культивированных в сходных условиях in vitro.

Клеточное культивирование in vitro нейронов ЦНС, и в частности сетчатки, является сложным экспериментальным подходом. В последнее время растет число работ, где используется органотипическое культивирование изолированной сетчатки взрослых низших (Kustermann et al., 2008) и высших позвоночных животных (Koizumi et al., 2007; Fernandez-Bueno et al., 2008; Johnson, Martin, 2008; Kaempf et al, 2008). Эти исследования выполнены с различными целями, однако ни одно не связано с изучением в сетчатке клеток, являющихся источником для ее восстановления.

3D органотипическое длительное культивирование позволяет не только следить за реконструкцией сетчатки, но и обнаружить популяции пролиферирующих и дедифференцированных клеток. В результате возникло предположение, что при таком способе культивирования "молчащие" клетки-предшественники могут быть стимулированы к делениям, а в дальнейшем, при направленном воздействии, и развитию в нейрональном направлении. Это дало бы возможность накапливать клетки для восполнения нейронов, утраченных в результате повреждения или заболеваний сетчатки.

Для ответа на другой вопрос, а именно, почему потенции ретинального пигментного эпителия (РПЭ) к трансдифференцировке в клетки сетчатки у низших и высших позвоночных проявляются в различной степени, необходимо получить модели in vivo-like in vitro, позволяющие культивирование РПЭ разных животных в сходных условиях. 

В 2010 г. проведено длительное органотипическое 3D культивирование целой сетчатки и РПЭ, полученных из глаз позвоночных животных разных классов (тритон и крыса). С применением иммунохимических маркеров пролиферирующих клеток и клеточных фенотипов доказано участие глиальных клеток (тритон и крыса), клеток ростовой зоны и минорных популяций в ядерных слоях (тритон) и гистиоцитов (крыса) в восстановлении/реконструкции сетчатки in vitro. Для тритона понижение уровня дифференцировки названных клеточных популяций in vitro впервые подтверждено при использовании молекулярных маркеров (ENTPDase, нуклеостемин, тубулин). У этих животных также впервые описан способ реконструкции/регенерации сетчатки за счет клеточного замещения в ее структуре без участия РПЭ. Показана возможность усиления выявленных регенерационных ответов в сетчатке тритона с помощью антиоксиданта SkQl, предотвращающего гибель пролиферирующих и вновь образующихся дедифференцированных клеток. В изолированной сетчатке взрослой крысы обнаружены митотические деления глиальных клеток и резидентных моноцитов, а также активная транслокация тел нейронов - ответов, расцененных как способность к реконструкции. В целом данные свидетельствуют о том, что в сетчатке позвоночных в условиях 3D культивирования происходит активация клеток, способных к делениям и трансформации фенотипа, а также молекулярных механизмов, ответственных за процесс понижения уровня клеточной дифференцировки.

При тех же способах анализа проведено сравнительное исследование ретинального пигментного эпителия (РПЭ) в составе задней стенки глаза взрослых тритонов и крыс. Выяснено, что поведение клеток РПЭ животных с полярными возможностями для регенерации in vivo (тритон и крыса), in vitro имеет некоторые сходства. У обоих видов они обладают ДНК-синтезирующей активностью, но редко входят в митотическую фазу, а, вымещаясь, приобретают макрофагальный фенотип. Клетки в слое РПЭ удерживают исходную морфологию, но при этом часть из них экспрессирует пан-нейральные белки (NF-200, vimentin).

Отличие клеток РПЭ тритона от таковых крысы выражается в его способности формировать in vitro ряды дедифференцированных NF-200+ клеток. Об изменении дифференцировки этих клеток в сторону понижения свидетельствует также выявленная с помощью ПЦР экспрессия гена нуклеостемина. Добавление в среду FGF2 усиливает пролиферацию и процесс дедифференцировки. В целом данные говорят о том, что РПЭ взрослых тритона и крысы сохраняет потенции к проявлению черт нейральных клеток предшественников, однако более глубокие изменения по пути ретинальной дифференцировки присущи только РПЭ тритона, где FGF2 является одним из основных регуляторов. Также при введении в среду культивирования РПЭ крысы антиоксиданта SkQl происходит существенное снижение, как клеточной гибели, так и проявления патологических изменений РПЭ, а именно его трансформации в макрофагальный фенотип.

Пренатальное развитие сетчатки

Изучение молекулярно-генетических механизмов пролиферации и дифференцировки клеток в ходе развития сетчатки человека представляет одну из фундаментальных проблем биологии развития и регенерационной медицины. Нарушения в работе генной сети, контролирующей клеточные процессы, лежат в основе большого числа врожденных аномалий развития глаза и патологий, затрагивающих сетчатку. Исследования экспрессии генов в развивающейся сетчатке человека являются базой для изучения репаративных возможностей сетчатки.

При повреждении сетчатки у высших позвоночных, в том числе у человека, начинаются пролиферативные процессы, которые не приводят к ее восстановлению и часто являются причиной возникновения патологий. В эмбриональном и взрослом глазу человека, в том числе в сетчатке, обнаружены клетки, по своим свойствам соответствующие стволовым. Прогресс в исследованиях молекулярных механизмов контроля клеточных процессов в ходе развития сетчатки, находится в неразрывной связи с поиском генов-регуляторов, которые могут быть маркерами, позволяющих локализовать малодифференцированные (прогениторные) клетки сетчатки, что важно для изучения ее регенерационных потенций. В связи с этим, представляет интерес исследование характераэкспрессии гена нуклеостемина (GNL3), кодирующего GTP-связывающий белок, который связан с ядерными механизмами контроля. Нуклеостемин участвует в обеспечении стабильности архитектуры ядра, биогенезе рибосом, в функционировании теломеразного комплекса в процессе деления клетки, в регуляции пролиферации клеток.

Высокий уровень экспрессии нуклеостемина был обнаружен в эмбриональных и нейральных стволовых клетках, в некоторых линиях раковых клеток млекопитающих, а также обнаружена экспрессия нуклеостемина в прогениторных клетках (нейробластах) раннего зачатка регенерирующей сетчатки пока взрослого тритона. Полученные результаты и данные литературы позволяют отнести нуклеостемин к группе генов-маркеров пролиферирующих и малодифференцированных клеток.

Экспрессия нуклеостемина в ходе развития сетчатки человека

С помощью метода ПЦР мРНК нуклеостемина была выявлена в сетчатке, с 11.5 по 26 неделю развития. На 11.5-12.5 неделе развития, с использованием метода иммунохимии, нуклеостемин был обнаружен практически во всех клетках сетчатки. Сетчатка на этих стадиях развития представлена двумя нейробластическими слоями - источниками формирования всех типов клеток сетчатки. На данной стадии развития, иммуноспецифический сигнал обнаруживается в сетчатке виде дискретных скоплений в ядрышках, нуклеоплазме прогениторных клеток.

На 22 неделе пренатального развития область локализации нуклеостемина значительно сужается: белок преимущественно детектируется в клетках ганглиозного слоя сетчатки, а также в отдельных клетках внутреннего ядерного слоя, дифференцировка которых еще продолжается. На этой стадии иммуноспецифическии сигнал был обнаружен в ядрышках и нуклеоплазме.

К 31 неделе пренатального развития дифференцировка всех типов клеток сетчатки близка к завершению. При сохранении специфичности экспрессии нуклеостемина, на поздней стадии развития наблюдается снижение числа нуклеостемин-позитивных клеток. Таким образом, на поздних стадиях формирования сетчатки, экспрессия нуклеостемина сохраняется лишь в отдельных клетках сетчатки, что согласуется с данными о наличии в этой структуре глаза прогениторных клеток, по крайней мере, до 31 недели пренатального развития. Представляет интерес тот факт, что по мере дифференцировки клеток происходит не только сужение области локализации нуклеостемина и ее смещение во внутренние слои сетчатки, но также изменение внутриядерной локализации нуклеостемина. На поздних стадиях развития сетчатки нуклеостемин локализуется главным образом на ядерной мембране, хотя в единичных клетках детектируется и в ядрышках, и в нуклеоплазме.

Экспрессия нуклеостемина на стадии нейробластических слоев практически во всех клетках развивающейся сетчатки может отражать его участие не только в контроле пролиферации клеток, но и в регуляции специфических синтезов. Данные о локализации нуклеостемина в развивающейся сетчатке человека в дифференцированных ганглиозных клетках и в клетках внутреннего ядерного слоя, на пути к терминальной дифференцировке, также свидетельствуют о том, что функция нуклеостемина в этой ткани глаза не ограничивается участием лишь в контроле пролиферации клеток. Локализация нуклеостемина на поздних стадиях дифференцировки клеток сетчатки человека сходна с таковой в дифференцированных клетках регенерирующей сетчатки тритона. Обнаруженная экспрессия нуклеостемина в отдельных клетках внутреннего ядерного слоя сетчатки человека на поздних стадиях пренатального развития свидетельствует о наличии популяции прогениторных клеток, которые могут рассматриваться как регенерационный резерв для восстановления сетчатки. Полученные данные являются базой для дальнейших исследований.

 

Доктор офтальмолог Левина ДарьяПодпишись на инстаграм офтальмохирурга
Доктор Левина поделится своим опытом с читателями проекта «eyes for me».