Оптогенетика

• Протезирование дегенеративной сетчатки
• Техническое протезирование
• Биологическое протезирование
• Физиологические особенности клеточных элементов сетчатки
• Фотоактивируемые белки
• Доставка и экспрессия гена (генов)

Оптогенетика - междисциплинарное направление, объединяющее генную инженерию, оптику и физиологию. Она позволяет с помощью свето-активируемого белка, ген которого добаляется и экспрессируется в совершенно определенной клетке сетчтаки регулировать светом (активировать или тормозить) ее физиологическую активность.

В отличие от генной терапии, призванной заместить или исправить поврежденный ген, задача оптогенетики - доставить в клетку ген светочувствительного белка как молекулярный "инструмент" управления ею.

Возможность оптогенетического протезирования дегенеративной клетки сетчатки определяется тем, что потяря фоторецепторных клеток, как правило, не сопровождается потерей идущих от них нервных волокон, во всяком случае ганглиозных клеток. Первые и успешные, с точки зрения возможности перехода к клиническим испытаниям , шаги сделаны в отношении дегенеративной сетчатки мышей (пигментный ретинит), которые удаось превратить в "псевдо-фоторецепторные" клетки с ON-OFF рецептивными полями, что принципиально важно для восстановления пространственного зрения.

В обзоре будут подробно рассмотрены следующие вопросы:

• выбор клеточных элементов дегенеративной сетчатки для её оптогенетического протезирования
• стратегия использования существующих и создания новых светочувствительных "инструментов" для оптогенетического протезирования
• доставка и экспрессия гена (генов) при оптогенетическом протезировании сетчатки
• способы оценки успешности оптогенетического протезирования;
• критерии отбора пациентов для оптогенетического протезирования
• в заключении обзора обсуждаются нерешённые задачи и перспективность применения оптогенетического подхода для протезирования дегенеративной сетчатки

Дегенеративные заболевания сетчатки глаза, приводящие к потере её фоторецепторных клеток, являются
основной причиной частичной и, в конечном счете, полной слепоты. Наследственные заболевания (дистрофии) сетчатки поражают 1 из 3000 человек. А самая распространённая форма дегенеративного заболевания сетчатки, возрастная макулярная дегенерация (ВМД) поражают, согласно Бюллетеню ВОЗ, 1 из 10 человек старше 60 лет.

Что касается ВМД, то в последнее время появились препараты, весьма эффективные в отношении поздней, т. н. "влажной" формы ВМД. Однако сколько-нибудь эффективных препаратов в отношении более ранней, т. н. "сухой" формы в настоящее время не существует. Не существует также способов предотвращения или лечения, например, такой наследственной формы дегенерации сетчатки как пигментный ретинит.
Суть проблемы сводится к тому, что сейчас нет способов восстановить зрение, если в ходе развития дегенеративного заболевания сетчатка теряет фоторецепторные клетки - палочки и колбочки.

Поэтому насущными задачами являются, с одной стороны, поиски научно-обоснованных подходов к профилактике и лечению (поиску сколько-нибудь эффективных лекарственных средств) дегенеративных заболеваний сетчатки глаза, а с другой стороны, поиски эффективных путей протезирования дегенеративной (утратившей фоторецепторные клетки) сетчатки.

Протезирование дегенеративной сетчатки

Принципиальная возможность протезирования дегенеративной сетчатки основана на том, что потеря фоторецепторных клеток, как правило, не сопровождается потерей следующих за ними нервных клеток сетчатки, во всяком случае, ганглиозных клеток. Отсюда следует целесообразность, по крайней мере, двух стратегий протезирования дегенеративной сетчатки: техническая и биологическая.

Под техническим протезированием понимается протезирование с помощью фотоэлектронных чипов. Под биологическим - во-первых, это создание или трансплантация новых фоторецепторных клеток и, во-вторых, придание сохранившимся ("здоровым") нервным клеткам светочувствительности, т.е. превращение их в "псевдо-фоторецепторные клетки".

Техническое протезирование

В течение, по крайней мере, двух последних десятилетий были приложены большие усилия и вложены значительные средства в попытки создания светочувствительных имплантов (микроэлектронных фоточипов), позволяющих хотя бы частично восстановить зрение при дегенеративных заболеваниях. При том, что в последнее время появились сообщения о впечатляющих успехах в этой области, однако в целом, в отличие от протезирования слуха, реальное техническое протезирование зрения сколько-нибудь широкого распространения не получило [см. дополнительный контент в конце обзора].

Целый ряд проблем, в том числе биосовместимость имплантов, остались нерешенными. С помощью фоточипов, как бы миниатюрны они не были и какое бы количество их не содержалось в имплантатах, практически невозможно "задействовать" сколько-нибудь значительное число здоровых ганглиозных клеток и их аксонов из миллиона существующих в сетчатке.

Биологическое протезирование

Интенсивные попытки создания из стволовых клеток новых фоторецепторных клеток в комбинации с совершенствованием методов тканевой инженерии успешно предпринимаются достаточно давно. Однако следует при этом иметь в виду, что молекулярные механизмы, обеспечивающие строго направленную клеточную дифференцировку соответствующих стволовых (прогенитальных) клеток, в основном остаются невыясненными. Также остаются неясными те требования, которые необходимо удовлетворить для успешной интеграции и сохранения в ткани (в фоторецепторном слое денегеративной сетчатки) уже доставленных туда новых клеток.

Совсем недавно в опытах in-vitro методами клеточной инженерии удалось получить сетчатку глаза [Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs, см. дополнительный контент]. Речь в данном случае идёт об образовании трёхмерной ткани сетчатки, содержащей в соответствующих слоях все её основные типы клеточных элементов, включая фоторецепторы, способные осуществлять фототрансдукцию, а от нервных клеток такой сетчатки отводились соответствующие их природе электрические потенциалы.

Оптогенетические методы позволили разработать способ создействия на ганглиозные клетки не извне (как при методах генной инженерии), а изнутри. Это физиологическое возбуждение или торможение нервных клеток осуществляется с помощью генетически "импланированных" в их плазматическую мембрану светочувствительных ионных каналов или иных светочувствительных оптогенетических "инструментов".

Первые и успешные с точки зрения возможности перехода к клиническим испытаниям шаги сделаны в отношении ганглиозных клеток дегенеративной сетчатки мышей (пигментный ретинит), которые удалось превратить в «псевдо-фоторецепторные» клетки с ON-OFF рецептивными полями. Конкретно, речь идёт о работе одной из ведущих в этой области лаборатории в Wayne State University School of Medicine в Детройте, опубликованной в 2013 г [rAAV-Mediated Subcellular Targeting of Optogenetic Tools in Retinal Ganglion Cells In Vivo, см. дополнительный контент].

В этой работе авторам удалось "имплантиовать" в плазматическую мембрану неповреждённых ганглиозных клеток дегенеративной сетчатки два канальных белка, при освещении которых оказалось возможным возбудить или затормозить активность этих клеток и восстановить ON- и OFF-центры их рецептивных полей, что является принципиально важным условием для обработки, посылаемой этими клетками в зрительные области мозга информации. Благодаря этому становится возможным восстановить, хотя бы частично, пространственное зрение.

Что касается "имплантированных" в этой работе управляемых светом ионных каналов, то речь идёт о семействе ретиналь-содержащих белков, т. н. канальных родопсинах (channelrhodopsin), способных при действии на них света переносить через плазматическую мембрану катионы или анионы. Обладателями этих родопсинов являются архебактерии или зелёные водоросли, т. е. это родопсины не животного происхождения. С родопсинами животного происхождения - зрительным пигментом родопсином или меланопсином - их связывает только то, что и те, и другие содержат в качестве хромофорной группы ретиналь и что топография лолипептидной белковой цепи в мембране у них одинаковая (полипептидная цепь 7 раз пересекает мембрану). Однако функционально это совершенно разные  светочувствительные белки. Для доставки гена светочувствительного канального родопсина в ганглиозные клетки дегенеративной сетчатки, используется хорошо известный вектор - рекомбиннатныи адено-ассоциированный вирус. Именно такой вирус разрешён для использования при генной терапии в офтальмологии.

Принципиально важным остаётся вопрос о белковых мишенях (белковых мотивах), которых должен достичь и на которые должен "сесть" в плазматической мембране ганглиозной клетки адено-ассоциированный вирус. В упомянутой выше работе американских авторов удалось идентифицировать два таких белковых мотива, явившихся мишенью для адено-ассоциированного вируса, доставившего гены канального родопсина-2 и галородопсина в плазматическую мембрану ганглиозной клетки.

Помимо "имплантируемых" в плазматическую мембрану ганглиозных клеток ретиналь-содержащих белков, переносящих катионы или анионы, и способных, таким образом, деполяризовать (возбудить) или гиперполяризовать (затормозть) физиологическую активность этих клеток и создать их ON-OFF рецептивные поля, вполне реальным могло бы быть "имплантирование" и других, модифицированных канальных ретиналь-содержащих белков, максимумы секторов поглощения которых находятся в различных областях видимого спектра.

В таком случае можно было бы надеяться на хотя бы частичное восстановление цветового зрения. Иными
вами можно было бы превратить ганглиозные клетки дегенеративной сетчатки не просто в "псевдо-фоторецепторы", а в "псевдо-колбочки". При комбинации двух канальных родопсинов, поглощающих свет в зеленой и синей областях спектра, можно было бы восстановить если не нормальное трихроматическое, то, по крайней мере, дихроматическое цветовое зрение.

Ещё одна заманчивая возможность - восстановить в ганглиозных клетках с помощью современных онтогенетических подходов весь ферментативный каскад усиления светового сигнала, наподобие каскада фоторецепции, существующего в фоторецепторных клетках. Речь идёт о генетической "имплантации" светочувствительных белков, способных активировать белки-ферменты.

Таким образом, онтогенетическое протезирование первую очередь протезирование ганглиозных клеток дегенеративной сетчатки, может уже в ближайшей перспективе привести к частичному восстановлению зрительного восприятия у полностью слепых пациентов, включая пространственное и даже цветовое зрение.

При выборе стратегии оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки важно учитывать физиологические особенности её клеточных элементов и принимать во внимание те патологические нарушения, которые в них происходят при той или иной форме заболевания. Важно понимать при этом, что в определённых клеточных элементах дегенеративной сетчатки нарушения могут и не происходить. В первую очередь к таким элементам относятся ганглиозные клетки. Следует также отдавать себе отчёт в том, что успешное оптогенетическое протезирование, выполненное на экспериментальных моделях, ещё не означает, что оно в неизменном виде может быть перенесено в офтальмологическую клинику.

Физиологические особенности клеточных элементов сетчатки

В ответ на поглощение света палочки и колбочки гиперполяризуются, возникающий в их наружном сегменте медленный гиперполяризационный потенциал распространяется до пресинаптического окончания. Быстрый нервный импульс в палочках и колбочках не возникает.

Исходя из того, что при некоторых формах дегенеративных заболеваний колбочки остаются на какое-то время жизнеспособными, одна из стратегий оптогенетического протезирования состоит в протезировании колбочек. При этом "имплантировать" в плазматическую мембрану колбочек следует "медленные" светочувствительные гиперполяризующие ионные каналы. В качестве такого канала был успешно использован бактериальный хлор-переносящий галородопсин. Если бы это удалось, то можно было бы восстановить физиологическую активность самого первого, фоторецепторного звена нервной сети сетчатки. Следствием такого успеха стало бы восстановление механизма естественной обработки зрительной информации всеми нижележащими нервными слоями сетчатке, т.е. всей её нервной сетью. В таком случае качество восстановленного зрительного восприятия, конечно, могло бы быть наилучшим. К сожалению, столь заманчивая стратегия протезирования колбочек представляется не слишком реальной, поскольку длительная жизнеспособность колбочек дегенеративной сетчатке маловероятна. Поэтому, при всём желании, колбочки не могут рассматриваться как наилучший объект для онтогенетического протезирования.

За фоторецепторными клетками следуют синаптически связанные с ними нейроны второго порядка - биполярные и горизонтальные клетки. Биполярные клетки в свою очередь распадается на два основных физиологических типа - ON- и OFF-биполяры. ON-биполяры в ответ на свет деполяризуются, OFF-биполяры гиперполяризуются. В биполярных клетках, как и в фоторецепторах генерируется только медленная электрическая активность. Нервные импульсы в них также не возникают.

Эти особенности электрических ответов фоторецепторных синаптически связанных с ними биполярных, а также горизонтальных клеток следует иметь в виду при планировании использования того или иного светочувствительного ионного канала, предполагаемого для генетической "имплантации" в плазматическую мембрану этих клеток.

Самые ранние признаки повреждения в нейральных слоях сетчатки наблюдаются в тех биполярных клетках, которые синаптически связанны с палочками, но не с колбочками. Среди целого ряда молекулярных и цитологических нарушений биполярных клеток следует указать на возможность изменения их полярности, т.е. на превращение ON-биполяров в OFF-биполяры. Это одно из принципиально важных ограничений их оптогенетического протезирования. Другое, в настоящее время методическое ограничение состоит в том, что специфический просмотр найден пока только для ON-, но не для OFF-биполяров. Вместе с тем, ON- биполяры сравнительно недавно были успешно протезированы с помощью "имплантации" в их плазматическую мембрану деполяризующего канала - канального родопсина-2.

В целом, однако, складывается впечатление, что биполярные клетки, как и фоторецепторы, не являются достаточно надёжным объектом для оптогенетического протезирования. Хотя в случае успеха также можно было бы сохранить значительный объём естественной обработки зрительной информации и достичь вполне приемлемого восстановления зрительных функций.

За биполярными и горизонтальными клетками следуют синаптически связанные с ними нейроны третьего порядка - амакриновые и ганглиозные клетки.

Весьма разнородные и многочисленные группы амакриновых клеток осуществляют сложнейшую обработку зрительной информации по горизонтали. Их роль в обработке зрительной информации чрезвычайно велика. Ганглиозные клетки являются "выходными" нейронами. Они получают сложнейшим образом обработанную во всех предыдущих слоях сетчатки зрительную информацию. В виде нервных импульсов эта информация поступает по аксонам ганглиозных клеток из сетчатки в мозг. При планировании генетической "имплантации" в плазматическую мембрану этих клеток светочувствительных ионных каналов речь должна идти о т.н. "быстрых" ионных каналах.

Для оптогенетического протезирования принципиально важно, что ганглиозные и амакриновые клетки наиболее устойчивы при развитии дегенеративного процесса. Они сохраняются неповреждёнными даже на поздних стадиях заболевания. Крайне важно также, что они сохраняют не только свои нормальные физиологические свойства, но и своё местоположение в сетчатке по отношению к внутренней пограничной мембране.

Таким образом, ганглиозная клетка как классическая нервная клетка с импульсной активностью и наиболее устойчивая при развитии дегенеративного процесса может рассматриваться как наиболее реальный кандидат для онтогенетического протезирования дегенеративной сетчатки.

Непреодолимым недостатком при таком протезировании становится потеря механизма сложной и естественной для здоровой сетчатки обработки информации во всех её вышележащих слоях. Поэтому для восстановления приемлемого зрительного восприятия потребуются специальные усилия, направленные на формирование достаточно адекватной зрительной информации, посылаемой сохранившимися ганглиозными клеткам в зрительные и незрительные области мозга.

Под "специальными усилиями" понимается создание таких искусственных способов создания и обработки информации, посылаемой ганглиозными клетками в мозг, которые позволили бы кодировать яркость и контраст изображения, воссоздать механизм адаптации к соответствующему уровню освещённости, восстановить пространственное зрение, цветовосприятие и многие другие физиологические свойства зрительной системы. Восстановление с помощью оптогенетического протезирования ганглиозных клеток хотя бы приемлемого зрительного восприятия стало бы большим успехом.

Следует отметить, что необыкновенная пластичность мозга позволяет надеяться на его способность к вполне приемлемой обработке даже такого рода несовершенной зрительной информации. Одним из наглядных примеров тому может служить способность зрительной системы человека со временем адаптироваться к той неестественной информации, которую она получает от имплантированных в дегенеративную сетчатку фотоэлектронных устройств.

Ганглиозных клеток и, соответственно аксонов, образующих зрительный нерв, около миллиона. Некоторая часть ганглиозных клеток сама обладает светочувствительностью поскольку содержит светочувствительный  ретиналь-содержащий пигмент меланопсин. Эти клетки посылают свои аксоны в незрительные (гипоталамические) области мозга. Они отвечают за синхронизацию циркадного ритма, регулирование размера зрачка и выделение мелатонина из эпифиза. Предприняты попытки использовать мелатонин, не являющийся ионным каналом, для оптогенетического протезирования.

Следует подчеркнуть, что ганглиозная клетка сетчатки - это классическая нервная клетка, в которой возникает спайк - быстрая импульсная активность. Именно эти клетки, как представляется на сегодняшний день, являются основными кандидатами, на онтогенетическое протезирование дегенеративной сетчатки.

Рассмотрим теперь клеточные элементы сетчатки точки зрения целесообразности и реальности их онтогенетического протезирования. Речь при этом пойдет о таких наиболее распространенных дегенеративных заболеваниях как пигментный ретинит и возрастная макулярная дегенерация.

Для удобства рассмотрения условно выделем три стадии дегенеративного процесса: сначала нарушения в фоторецепторных клетках, затем дегенерация этих клеток, и, наконец, нарушения в нейральной части сетчатки - ниже расположенных нервных слоях, включая как ее нервные, так и глиальные клетки.

При пигментном ретините фоторецепторные клетки гибнут, причём палочки раньше колбочек. Жизнеспособность колбочек может сохраняться достаточно долго. Однако, в конечном счёте, колбочки гибнут тоже. При некоторых других формах дегенерации ситуация может быть обратной: колбочки повреждаются раньше палочек. Практически одновременно с потерей палочек и колбочек происходит миграция и потеря клеток ретинального пигментного эпителия.

Ярким примером исключительной пластичности мозга может служить создание у обезьян-дихроматов с помощью методов современной генной терапии трихроматического зрения. Мозг обезьян достаточно быстро и эффективно адаптировался к такому новому для него "человеческому" зрению.

Весьма перспективными в этой области становятся работы по созданию систем кодирования светового сигнала с тем, чтобы оптогенетически протезированные ганглиозные клетки получали информацию в "привычном" их виде. Многообещающим также является возможность голографической стимуляции протезированной сетчатки.

"Оптогенетика для зрения" во многих отношениях существенно отличается от "оптогенетики для мозга". Во-первых, существенно различаются по спектральной характеристике и интенсивности параметры светового стимула. Если, например, для возбуждения или торможения импульсной активности нейронов мозга интенсивность светового стимула не является принципиальной, то слишком яркий стимул для сетчатки недопустим, поскольку способен вызвать фотоповреждение её клеточных элементов. Во-вторых, физиологические свойства разнородных клеток сетчатки отличны от свойств нейронов мозга. В большинстве клеток сетчатки, как было сказано выше, - в фоторецепторных, биполярных и горизонтальных клетках - генерируется лишь медленная электрическая активность, и лишь в ганглиозных клетках возникают спайки, т.е. быстрая импульсная активность, подобная нейронам мозга.

Фотоактивируемые белки

К данной группе относятся 

• Родопсины (растительного и бактериального происхождения)
• Меланопсины
• Химический "фотопереключатели" (например тип AAQ)
• Ионные глутаматные рецепторы

Трудно сказать, удивительно это или закономерно, но открытие в 1876 году зрительного пигмента родопсина и его подробнейшее изучение как светочувствительного ретиналь-содержащего белка и, одновременно, как G-белок-связывающего рецептора, а затем открытие в начале 70-х годов прошлого века бактериородописна привело, в конечном счёте, к созданию всего несколько лет назад "инструментов" оптогенетики - родопсинов микробиального происхождения. Конечно, зрительные родопсины животного происхождения и микробиальные родопсины - это разные белки с совершенно разными функциями, хотя и предполагается что микробиальные родопсины и родопсины многоклеточных гомологичны и что первые являются предшественниками вторых.

Как бы то ни было, и те, и другие - это мембранные белки, топография которых в мембране принципиально одинакова, хромофор которых - ретиналь также одинаков, но только находится в различных изомерных конфигурациях. Одна и та же фотохимическая реакция - фотоизомеризации ретиналя "запускает" конформационные перестройки белковой части этих молекул, тем самым, активируя их функции -инициацию фототрансдукции в случае зрения или пассивный или активный перенос ионов в случае фототаксиса или бактериального фотосинтеза.

Три класса родопсинов бактерий и зелёных водорослей находят в настоящее время применение в оптогенетике. Это класс ионных каналов, а именно свето-управляемый канальный родопсин (channelrhodopsin \ChRA\) из зелёной водоросли Chlamydomonas (и его мутанты - биоинженерные модификации), и два класса ионных насосов - хлор-переносящий галородопсин из бактерии Natronomas faraonis (NphR) (и его мутанты) и бактериородпсин, а именно фотоактивируемый протонный насос археародопсин-3 (Arch3) Halorubriim sodomense.

Что касается канального родопсина, то наибольшее распространение, в том числе, в оптогенетике зрения, получил катионный канальный родопсин-2 (channelrhodopsin-2 \ChR2\) из зелёной водоросли Chlamydomonas reinhardii. Будучи экспрессирован в нервной клетке и встроен в её плазматическую мембрану, канальный родопсин-2 при действии синего (470 нм) света быстро (в пределах 50 миллисекунд) деполяризует её. Одним из важных его недостатков остаётся неселективность. Попытки модифицировать его в селективный катионный канал - натриевый, калиевый или кальциевый пока не увенчались успехом. Вместе с тем, для оптогенетики в целом, и для оптогенетики мозга и сетчатки в частности, это представляется крайне важным. Например, создание кальций-селективного ионного канала позволило бы подробно исследовать и управлять внутриклеточной передачей сигнала, в которой кальций важнейший внутриклеточный посредник, синаптический передачей, в которой кальций играет ключевую роль, и многими другими важнейшими физиологическими функциями.

При одновременной экспрессии в нервной клетке деполяризующего её плазматическую мембрану канального родопсина-2 (ChR2), поглощающего синий свет, и гиперполяризующего мембрану галородопсина (NphR), поглощающего жёлтый свет, появляется возможность, чередуя синие и жёлтые вспышки света, возбуждать и тормозить нервную клетку, т.е. управлять её физиологической активностью. Именно такой подход был применён для создания ON-OFF- рецептивных полей ганглиозной клетки дегенеративной сетчатки.

В последнее время попытки спектральной настройки канального родопсина увенчались успехом. Так, например, была получена биоинженерная конструкция, состоящая из химеры канального родопсина-1 хламидомонады и канального родопсина-1 вольвокс, поглощающая свет в области от 526 до 545 нм, и канального родопсина-2 хламидомонады, поглощающего в области 461 до 492 нм. Такая сложная конструкция, если бы её удалось применить при оптогенетическом протезировании дегенеративной сетчатки, позволила бы возбудить две или даже три различных популяции ганглиозных клеток, соответственно красным, синим и зелёным светом, превращая их в набор "псевдо-колбочек" для трихроматического зрения.

Недавно создан новый красно-активируемый вариант канального родопсина (red-activatable ChR - ReaChR), который возбуждается оранжево-красным светом (Л -590-630 нм). Этот родопсин, в отличие от существующих красно-чувствительных канальных родопсинов, намного лучше встраивается в плазматическую мембрану нервной клетки и генерирует существенно большие фототоки с более быстрой кинетикой. Самым же важным для исследования мозга и вполне вероятного клинического применения является то, что такой деполяризующий мембрану канальный родопсин позволяет возбуждать нейроны инфракрасным светом через интактный череп. Это означает, что отпадает необходимость в создании в черепе хирургического "окна" и имплантации в мозг оптического волокна.

Совсем недавно появилась принципиально важная работа в которой сообщается о качественном изменении канального родопсина. Впервые удалось создать канальный родопсин, способный переносить не катионы, а анионы. Существующие в настоящее время катион-переносящие канальные родопсины способны деполяризовать плазматическую мембрану. Они широко используются в оптогенетике для возбуждения нервных клеток и мозга, и сетчатки. Для торможения же, как правило, использовался другой свето-управляемый, анион-переносящий канал, например, хлор-переносящий галородопсин. Созданный же авторами с помощью методов современной биоинженерии вариант анион-переносящего канального родопсина, у которых в области селективного фильтра отрицательно заряженный аминокислотный остаток был заменён на положительный, способен при действии света гиперполяризовать плазматическую мембрану. Это означает, что он с успехом может быть использован для торможения физиологической активности нервной клетки. По-существу, речь идёт о функционально важном расширении семейства канальных родопсинов переносящих не только катионы, но и анионы хлора (chloride-conducting ChRs).

Когда речь идёт о повышении их световой чувствительности, то имеется в виду не повышение квантового выхода реакции фотоизомеризации их ретиналевого хромофора - он и так достаточно высокий, а имеется в виду требуемое количество квантов света, которое необходимо для деполяризации мембраны нервной клетки для генерации спайка - нервного импульса. Этот физиологический (импульсный) ответ нейрона, и в частности ганглиозной клетки, зависит от степени рассеяния света биологической тканью, уровня экспрессии гена канального белка в плазматической мембране, кинетики открывания и закрывания канала, величины его проводимости и ряда других факторов. Эти и многие другие насущные в отношении оптогенетики мозга и сетчатки вопросы подробно обсуждаются в работах последних лет.

Поскольку родопсины бактериального происхождения, в отличие от зрительных родопсинов, не являются G-белок связывающими рецепторами и, следовательно, не способны запускать ферментативный каскад усиления светового сигнала, то одной из основных задач остаётся повышение их световой чувствительности и/или сопряжение их с ферментативным усилительным каскадом. 

Преимуществом меланопсина как инструмента оптогенетики является то, что он требует гораздо меньшую интенсивность света для для активации импульсной активности клетки. Но его значительным недостатком является медленная кинетика (особенно "выключения").

Как бы то ни было, успешные попытки использовать меланопсин для оптогенетического протезирования дегенеративной сетчатки были предприняты. Так, используя адено-ассоциированый вирус 2 (AAV-2), меланопсин был экспрессирован в ганглиозные клетки дегенеративной сетчатки мыши, включая и те клетки, которые посылают свои аксоны в зрительные области мозга. В результате, примерно через неделю после введения в ганглиозные клетки гена меланопсина, у мышей, согласно электрофизиологическим реакциям одиночных ганглиозных клеток сетчатки и зрительным поведенческим реакция, восстанавливалось зрительное восприятие.

Ещё одно направление - это синтез и использование не-оптогенетических инструментов для протезирования дегенеративной сетчатки. Речь идёт о химических "фотопереключателях", которые вводятся в глаз (интраокулярная инъекция) и которые при действии света непосредственно активируют ионные каналы плазматической мембраны нервных клеток. Примером такого фотопереключателя является химическое соединение AAQ, состоящее из молекулы четвертичного аммония, блокирующего потенциал-зависимые калиевые каналы, азобензена - собственно светочувствительного переключателя и акриламида, связывающего всю конструкцию с ионными каналами плазматической мембраны. Но на данном этапе разработок у данных структур слишком короткое время жизни in vivo.

Предназначенный для оптогенетики ионотропный глутаматный рецептор состоит из собственно глутаматного рецептора, к которому в качестве хромофора ковалентно "пришит" светочувствительный азобензен и, в свою очередь, с которым ковалентно связана молекула глутамата. При действии света (380 нм) на такую конструкцию конформационное изменение (фотоизомеризация) азобензена приводит к связыванию глютамата с глутаматным рецептором, что, в свою очередь, приводит к открыванию в рецепторе поры для прохождения ионов натрия, калия и кальция и, как следствие, к деполяризации плазматической мембраны. При выключении же света азобензен возвращается в неактивное состояние, а при действии света другой длины волны (500 нм) возвращение в неактивное состояние происходит очень быстро. Такая система способна генерировать в ганглиозной клетке сетчатки импульсную активность с частотой до 50 Гц.

Доставка и экспрессия гена (генов)

По крайней мере, три проблемы должны быть решены для успешной доставки и экспрессии гена в избранной клетке сетчатки. Во-первых, какую вирусную систему выбрать, во-вторых, в какие именно клетки ген с помощью вируса доставить и, наконец, в-третьих, - как добиться эффективной экспрессии гена (или генов) в избранной клетке.

Что касается вирусной системы, то становится очевидным, что рекомбинантный адено-ассоциированный вирус (серотип 2 (AAV2)) является на сегодняшний день в генной терапии наилучшим носителем для доставки гена in vivo в силу своей непатогенности и неиммуногенности, вполне приемлемой скорости доставки гена как к делящимся, так и к неделящимся клеткам, и способности инфицировать широкий круг клеток и тканей.

Что касается самого непосредственного введения патогенетической конструкции в глаз, то возможна или
субретинальная инъекция, если речь идёт о протезировании фоторецепторных клеток или клеток наружного ядерного слоя, или интравитреальная инъекция, если речь идёт о протезировании клеток внутренних слоев, в первую очередь ганглиозных клеток. Говоря об интравитреальной инъекции, следует помнить, что глаз мыши - не глаз примата и что способность вируса достичь слоя ганглиозных клеток у них не одинаковая. Речь идёт о внутренней пограничной мембране, которая у грызунов легко проницаема для вируса AAV2, а у приматов и, соответственно, человека, трудно проницаема из-за большого количества гепарин-сульфат связывающих центров и относительно её гораздо большей толщины, по сравнению с мышью. Однако в некоторых местах у приматов и человека внутренняя пограничная мембрана для вируса AAV2 всё-таки проницаема, а именно она вполне проницаема в области фовеальной ямки и вокруг ретинальных артериол.

Для оценки успешности оптогенетического протезирования у человека могут быть использованы:

• Электроретинограмма. Она отражает активность фоторецепторов и синаптически связанных с ними нервных клеток внутреннего ядерного слоя (биполярных и горизонтальных клеток) и глиальных Мюллеровских клеток. В отсутствии фоторецепторов у дегенеративной сетчатки регистрация ЭРГ становится бессмысленной. Она могла бы быть полезной, если бы удалось протезировать сохранившиеся колбочки. Однако протезирование сохранившихся фоторецепторных, как указывалось выше, малоперспективно.
• Поля зрения - измерение пороговой чувствительности может оказаться весьма полезным.
• Острота зрения, хоть и является важным показателем, но не всегда коррелирует со степенью восстановления зрительных функций.
• Зрительно вызванные потенциалы могут являться важным показателем, при их даже минимальном регистрировании, т.к. до начала протезирования они обычно не вызываются.
• Функциональная магнитно-резонансная томография и оптическое картирование мозга
• Зрачковый рефлекс
• Зрительное поведение пациента

Одним из критериев отбора пациентов является оптическая когерентная томография, которая позволяет оценить состояние всех слоев сетчатки. В дегенеративной сетчатке первичные  признаки обнаруживаются в ее утончающемся наружном ядерном слое, т.е. в ядрах палочек и колбочек.

Первичными кандидатами для онтогенетического протезирования могут быть пациенты, у которых не обнаруживаются наружные сегменты палочек и колбочек и наружный ядерный слой с сохранными ганглиозными клетками.