- Молекулярные механизмы действия нейротрофических факторов 
- Защитные свойства нейротрофических факторов 
- Нейротрофический фактор мозга BDNF
- Глиальный нейротрофический фактор (GDNF)
Нейротрофические факторы – большая группа полипептидов (до 200 а.о.), организованных в одно- и двухцепочечные формы, – играют ключевую роль в развитии и сохранении структур как центральной, так и периферической нервной системы. Они принимают участие в регуляции роста, развития, дифференцировки и выживания клеточных популяций, процессах их адаптации к внешним воздействиям. В настоящее время известно не менее восьми семейств нейротрофических факторов, хотя у разных авторов встречаются некоторые расхождения в их классификации. Секретируемые нейрональными структурами (нейронами, глией), они выполняют сигнальную миссию в большом спектре физиологических процессов. НТФ осуществляют структурную и функциональную организацию как отдельных клеток мозга, так и нейрональной сети в целом, являясь регуляторами нейрональной пластичности. Одна из основных функций НТФ связана со способностью противостоять окислительному стрессу и апоптозу.
Первый нейротрофический фактор, фактор роста нервов (NGF), был открыт в начале 50х годов и через 30 лет был обнаружен нейротрофический фактор мозга (Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF). Открытие BDNF вызвало обостренный интерес и привлекло внимание ко всем нейротрофическим факторам. Как вскоре выяснилось, BDNF обладает замечательным свойством стимулировать рост нейронов, аксонов и дендритов, формирование синапсов и другие процессы нейропластичности не только в раннем онтогенезе, но и в мозге взрослого организма, что раньше считалось невозможным. В настоящее время BDNF – один из наиболее изученных нейротрофических факторов центральной нервной системы. Нейротрофические факторы разных семейств обладают общими свойствами, но особое внимание привлекают те из них, которые влияют на функционирование нейромедиаторных систем мозга. Так BDNF тесно связан с серотонинергической (5-HT) системой мозга, а глиальный нейротрофический фактор (Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor, GDNF) оказывает выраженное защитное действие на нигростриарную и мезолимбическую дофаминовую (ДА) систему мозга и считается дофаминергическим.
На основании структурной гомологичности аминокислотных последовательностей НТФ делятся на три подсемейства:
- собственно «нейротрофины», куда относятся NGF (Nerve Growth Factor), BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor), NF-3 (Neurotrophin-3), NF-4/5 (Neurotrophin-4/5);
- подсемейство глиального фактора, которое включает GDNF (Glial Cell Derived Neurotrophic Factor), Neurturin (NTR), Artemin (ART), Persephin (PSP); а также
- подсемейство цилиарного фактора, включающего CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor), LIF (Leukemia Inhibitory Factor) и IL-6 (интерлейкин-6).
Молекулярные механизмы действия нейротрофических факторов
Было установлено, что в норме ГКС, клетки решетчатой пластинки и астроциты головки зрительного нерва млекопитающих экспрессируют рецепторы TrkA, TrkB и p75NTR к следующим нейротрофическим факторам: BDNF, NGF, NT3 и NT4.
Обнаружена избирательность связывания определенного нейротрофина с рецепторами, например, NGF предпочтительно взаимодействует с Trk-A, а BDNF – с Trk-B, тогда как NT-3 – c Trk-C- или с Trk-A-рецепторами. В то же время все названные выше нейротрофины взаимодействуют с «универсальным» рецептором – p75NTR.
Взаимодействуя с Trk-рецепторами, нейротрофины активируют несколько путей внутриклеточной передачи сигнала, однако PI3K/ Akt сигнальный путь является особенно важным для выживания нейронов и синтеза многих клеточных белков. Связывание НТФ с Trk-рецепторами приводит к преобразованию фосфатидилинозитол-3-фосфата в фосфатидилинозитол-3,4,5-трисфосфат под действием фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), что приводит к активации протеинкиназы B (Akt). Активация Akt делает клетки устойчивыми к действию апоптотических стимулов через фосфорилирование и инактивирование проапоптотических белков Bad и каспазы-9, а также транскрипционных факторов. Так Akt контролирует большой класс транскрипционных факторов FOXO (Forkhead box, group O) и препятствует их способности индуцировать экспрессию генов смерти.
Роль p75NTR очень сложна, так как он является низкоаффинным рецептором НТФ, взаимодействует с NT-3, NT-4/5, NGF, BDNF. Их связывание может привести как к апоптозу, так и к выживанию клеток.
Исследования in vitro показали, что одновременная соэкспрессия рецепторов TrkA и p75NTR повышает чувствительность нейронов к более низким концентрациям НТФ.
Защитные свойства нейротрофических факторов
Среди большого семейства НТФ в последнее время наибольшее внимание исследователей привлекают фактор роста нервов (NGF) и нейротрофический фактор головного мозга (BDNF).
NGF представляет собой димер, содержащий две идентичные субъединицы по 118 аминокислотных остатков, с молекулярным весом около 26 кДа. В центральной нервной системе NGF является ключевым нейротрофином, и нарушение его регуляции может быть вовлечено в патогенез различных нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и рассеянный склероз.
Одним из важнейших эффектов NGF служит ретроградный транспорт молекулы по аксону – от синаптической мишени-рецептора до ядра соответствующего нейрона. Экспериментальное снижение уровня NGF (введение анти-NGF-антител или прерывание ретроградного транспорта по аксону) приводит к дегенерации соответствующих симпатических и сенсорных нейронов.
Применение NGF в животных моделях нейродегенеративных заболеваний предотвращает дегенерацию нейронов. Клинические исследования показали, что применение NGF у пациентов с болезнью Альцгеймера приводит к нормализации данных электроэнцефалографии и повышению когнитивных функций.
В экспериментальных исследованиях было установлено наличие выраженного защитного эффект внутриглазного применения NGF при глаукоме.
В литературе имеются данные о клиническом применении NGF у больных первичной открытоугольной глаукомой. В рамках этой работы на протяжении 3-х мес. наблюдались 3 пациента с далеко зашедшей стадией ПОУГ, которым ежедневно проводились инстилляции глазных капель, содержащих NGF (200 мкг/ мл). Результаты психофункциональных и электрофункциональных исследований у этих пациентов выявили, что электрофизиологические изменения сопровождались улучшением клинических показателей: MD (mean deviation) был увеличен с 0 до 5% у всех пациентов к концу лечения NGF и с 1 до 15,8% через 3 мес. после прекращения терапии. При этом у двоих пациентов показатели остроты зрения и поля зрения остались стабильными спустя 18 мес. Этот «долгосрочный» эффект NGF может быть связан не только с противоапоптотической активностью, но и со способностью к образованию новых нервных путей, так как известно, что NGF стимулирует нейронную пластичность и регенерацию аксонов.
BDNF димер с общим молекулярным весом 27,2 кДа структурно сходен с NGF; идентичность аминокислотной последовательности BDNF из свиньи и крысы свидетельствует о его видовой консервативности. С помощью рекомбинантного BDNF человека было доказано существование ретроградного аксонального транспорта BDNF, который в последующем был идентифицирован в ипсилатеральной и контралатеральной коре переднего мозга, латеральном гипоталамусе, структурах locus coeruleus и в других отделах мозга. BDNF обладает выраженными нейропротекторными свойствами и выполняет важную роль в предупреждении развития апоптоза нервных клеток. В экспериментальных моделях глаукомы было выявлено, что BDNF принимает активное участие в процессах нейротрофической регуляции и дизрегуляции. У животных в процессе развития экспериментальной глаукомы наблюдается резкое снижение содержания BDNF во внутриглазных структурах, а его введение или повышение содержания в структурах глаза предотвращает развитие повреждения ГКС.
При трехкратном интравитреальном введении BDNF в глаза крыс с повышенным в 2,5 раза ВГД после второй и третьей инъекций отмечалось увеличение выживания ГКС, что составило 91,3 и 82,7% соответственно, и оказалось статистически значимым отличием по сравнению с результатами, полученными в контрольной группе.
В последнее время растет интерес к возможному применению генной инженерии для доставки BDNF к клеткам сетчатки. Достигнуты хорошие результаты в исследованиях in vitro: показано, что ГКС, трансфицированные аденоассоциированным вирусом, способны к выработке BDNF. Аналогичные результаты получены при интравитреальном введении животным ДНК BDNF с помощью вирусного вектора, выявлен повышенный синтез нейротрофина и значительный нейропротекторный эффект терапии.
Данные исследования показывают, что повышение уровня НТФ является патогенетически обоснованным и эффективным методом лечения глаукомной оптической нейропатии. Однако вопрос о безопасной и устойчивой доставке НТФ остается камнем преткновения. С данной точки зрения интересным представляется возможность применения стволовых клеток.
Нейротрофический фактор мозга BDNF
BDNF наиболее широко (по сравнению с другими нейротрофическими факторами) представлен в мозге. Это относится и к многообразию структур мозга, и к уровню экспрессии BDNF. По современным представлениям, ген BDNF человека локализуется в p14-регионе 11 хромосомы и содержит 12 экзонов, 9 из которых имеют специфические промоторы (I–VIII 5'-экзоны сплайсирующиеся с общим 3'-экзоном IX).
Как транскрипты мРНК, так и белок BDNF широко представлены в неокортексе, гиппокампе, миндалине и мозжечке. BDNF отличается структурной и функциональной сложностью, которая обусловлена
- наличием нескольких промоторов в кодирующем гене;
- экспрессией множества транскриптов, подверженных альтернативному сплайсингу или имеющих различные паттерны полиаденилирования;
- несколькими изоформами предшественника, но только одной формой зрелой молекулы;
- существованием двух различных рецепторов (TrkB и p75), активация которых вызывает противоположные эффекты.
Все эти особенности определяют сложность селективного молекулярного механизма, регулирующего продукцию и функциональную активность BDNF. Сложная транскрипционная регуляция BDNF вовлекает и эпигенетические факторы. Промоторы I, II и IV гена BDNF человека и I, II, IV–VI и IX гена Bdnf грызунов насыщены CpG- островками (богатые CG участки ДНК), что делает их мишенями для процессов метилирования/деметилирования. Имеются многочисленные доказательства участия метилирования гена Bdnf в регуляции нормальной активности нейронов и в патологических процессах. Значительный вклад в эпигенетический контроль экспрессии BDNF вносит также деацетилирование гистонов. Чаще всего модификации подвергаются гистоны Н3 и Н4 в промоторах I и IV, что может иметь критическое значение для реализации нейропластических процессов, действия антидепрессантов и стабилизаторов настроения. Недавно стало известно, что экспрессию гена Bdnf могут регулировать и анти-BDNF транскрипты (микроРНК). Транскрипция BDNF в нейронах позитивно регулируется с помощью деполяризации мембраны, индуцируемой сенсорными стимулами, а также активацией NMDA-рецепторов глутамата. Наличие множества промоторов и альтернативного сплайсинга приводит к появлению, по меньшей мере, 17 транскриптов (у человека) с различными 5'- и 3'-нетранслируемыми областями (untranslated region, UTR). Тем не менее все они имеют общую кодирующую область, включающую экзон IX, содержащий полную последовательность молекулы его предшественника – proBDNF. Кроме того, этот экзон содержит два сайта полиаденилирования, производящих транскрипты с длинной, либо короткой 3'-UTR.
Это имеет важное функциональное значение, поскольку мРНК с длинной 3'-UTR локализована преимущественно в шипиках дендритов и транслируется в ответ на активацию нейронов. Напротив, мРНК с коротким 3'-UTR активно транслируется в телах нейронов для поддержания базального уровня белка BDNF. BDNF производится «по требованию» в ответ на нейрональную активность из белка-предшественника pre-proBDNF, который разрезается до proBDNF в аппарате Гольджи.
В мозге proBDNF ожидает три возможных исхода:
- секретироваться и функционировать в виде proBDNF;
- подвергнуться редактированию в комплексе Гольджи и секретироваться в качестве зрелой молекулы BDNF;
- секретироваться в виде proBDNF и «дозреть» до BDNF в синаптическом пространстве.
Эффекты зрелого BDNF реализуются путем активации двух типов рецепторов – тропомиозинового тирозинкиназного B рецептора (tropomyosin-related kinase B receptor, TrkB) и неспецифичного р75-рецептора. Однако экспрессия TrkB-рецептора значительно выше, отношение TrkB/p75 в большинстве структур мозга достигает 8–10. Это определяет превалирующую роль TrkB-рецептора, инициирующего каскады фосфорилирования, что, в свою очередь, приводит к синтезу белка, росту аксонов, созреванию дендритов, увеличивая синаптическую пластичность. В отличие от BDNF, proBDNF связывается с общим для нейротрофинов p75-рецептором и ингибирует рост нейритов, сокращает размеры нейронов и запускает процессы апоптоза.
Вызывает интерес соотношение зрелой формы BDNF и его предшественника BDNF/proBDNF. Противоположные функции BDNF и его предшественника proBDNF дают основание считать соотношение BDNF/proBDNF важнейшим ауторегуляторным механизмом синаптической пластичности, а его снижение, вызванное увеличением предшественника или понижением уровня BDNF, – одним из патогенетических факторов нейро- и психопатологий.
Экспрессия BDNF чувствительна к таким воздействиям как стресс, травма, гипогликемия, ишемия и повреждения мозга. Экспрессия BDNF модулируется большим числом фармакологических агентов, мишенями которых являются самые разные нейротрансмиттерные системы. Полагают, что нарушения в генетическом и эпигенетическом контроле метаболизма, транспорта или передачи сигнала BDNF способствуют развитию ряда неврологических и психических расстройств, включая болезнь Альцгеймера, Хантингтона, Паркинсона, невропатическую боль, шизофрению, тяжелые депрессивные расстройства, аддикцию.
Глиальный нейротрофический фактор (GDNF)
Первоначально GDNF был выделен из культуры клеток глиомы и, как оказалось, содержится преимущественно в астроцитах, являясь основным продуцентом этих клеток. Необходимо отметить, что в последнее время патологии астроцитов придается важнейшее значение в возникновении дегенеративных процессов в центральной нервной системе человека. Сразу же было показано трофическое действие GDNF на культуру дофамин (ДА) -нейронов, и в настоящее время GDNF получил признание как фактор, необходимый для развития, поддержания и защиты нигростриатных ДА-нейронов, в т.ч. как потенциальный фактор, защищающий и восстанавливающий ДА-нейроны, пораженные при болезни Паркинсона.
Вместе с тремя другими структурно родственными факторами – нейротурином, артемином и персефином GDNF образует семейство нейротрофических факторов, входящее в суперсемейство трансформирующего ростового фактора β. Члены семейства GDNF передают сигнал через экстраклеточные рецепторы (GFRα1–4), каждый из которых селективен для соответствующего члена семейства. GDNF проявляет наиболее высокую аффинность к GFRα1. Рецепторный комплекс GDNF–GFRα1 связывается с экстраклеточным доменом рецепторной тирозинкиназы, модулируя различные внутриклеточные сигнальные каскады.
В дополнение GDNF может напрямую связываться с молекулами нейрональной клеточной адгезии (NCAM) c последующей активацией Src-подобных киназ и МАР-киназы. GDNF имеет биологически активную про-форму (proGDNF), которая экспрессируется в большинстве отделов мозга и обнаружена как в астроцитах, так и в ДА-нейронах.
Кроме GDNF, при разрезании proGDNF образуются пептиды, известные как DNSP-11 также обладающие биологической активностью. BEP усиливает синаптическое возбуждение в пирамидальных нейронах гиппокампа, а DNSP-11 так же эффективно защищает ДА-нейроны, как и зрелая форма GDNF. Распространение GDNF и его рецепторов не ограничено областью ДА-нейронов среднего мозга. Рецепторы GDNF, как и его транскрипты и белок, обнаружены во многих других структурах мозга, указывая на то, что GDNF может выполнять разнообразные функции. Среди них – участие в синаптогенезе в гиппокампе, где GDNF и GFRα1 играют инструктивную роль в формировании синапсов, индуцируя эктопические пресинаптические сайты.
GDNF участвует в поддержании клеточных элементов гематоэнцефалического барьера. Увеличение экспрессии proGDNF после введения бактериального липополисахарида и повышение образования GDNF астроцитами и клетками микроглии, наблюдаемое при воспалении, указывает на GDNF как на активатор микроглии и ингибитор нейронального воспаления. Благодаря разнообразию выполняемых функций, GDNF, с одной стороны, участвует во многих физиологических процессах, с другой – в патогенезе ряда неврологических и психических расстройств.
Известно о вовлечении GDNF в механизмы старения, болезни Паркинсона, Альцгеймера, Хантингтона, бокового амиотрофического склероза, эпилепсии и ряда нейропсихических расстройств, таких как биполярное расстройство и униполярная депрессия. На экспрессию GDNF могут влиять различные факторы, одним из которых служит хронический стресс. Хорошо известно, что длительные стрессовые воздействия являются фактором риска для развития психических расстройств, включая депрессию. «Гормоны стресса» глюкокортикоиды могут подавлять экспрессию и секрецию GDNF, вызывая эпигенетические эффекты множеством разнообразных путей. Так, хронический ультрамягкий стресс повышает метилирование ДНК, связанное с модификацией гистонов, что приводит к репрессии транскрипции Gdnf и формированию более восприимчивого к депрессии фенотипа мышей. Изменить ответ нейрона на GDNF могут и микроРНК путем подавления рецепторов GFRα1а (специфичной изоформы гена GFRA1), что и обнаружено в базолатеральной миндалине субъектов, страдавших от депрессии. Индукторами экспрессии GDNF также являются низкокалорийная диета, физические упражнения и обогащенная среда.