Перспективы в лечении дегенеративных заболеваний сетчатки

Перспективы регенерации клеток сетчаткиМногие заболевания глаза, приводящие к потере зрения, такие как пигментный ретинит, отслойка сетчатки, связанная с возрастом макулярная дистрофия, заболевания сетчатки при диабете и глаукоме сопровождаются гибелью нейронов сетчатки. Для того чтобы научиться лечить эти и другие заболевания сетчатки необходимо, в частности, выявить клеточные источники регенерации и найти способы их стимулировать.

У взрослых млекопитающих поврежденная сетчатка, как и другие отделы ЦНС, не регенерирует, а погибшие клетки не могут быть замещены образующимися denovo. Это связано с потерей способности ретинальных клеток взрослых млекопитающих к пролиферации и жестко стабилизированной дифференцировкой нейронов сетчатки. Тем не менее, это не означает, что эта ткань не располагает скрытыми внутренними клеточными источниками и механизмами для восстановления. Последние годы характеризуются наиболее активным поиском этого ресурса, локализующегося как внутри самой сетчатки, так и вне ее, но в пределах глаза.

Способность восстановления сетчатки in vivo за счет клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) обнаружена у многих животных в эмбриональном и личиночном состоянии еще в 1983. У взрослых животных такие примеры - исключение. Наивысшей способностью к регенерации сетчатки обладает РПЭ взрослых тритонов . В основе регенерации сетчатки у этих животных лежит активно изучаемый на протяжении многих лет в лаборатории проблем регенерации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития процесс трансдифференцировки клеток РПЭ в нейроны и глиальные клетки сетчатки. У взрослых млекопитающих, в частности крыс, РПЭ не проявляет способности к замещению погибших клеток сетчатки ни в одной из известных моделей ее повреждения. Тем не менее, в 2005 году было показано, что у птиц и млекопитающих клетки РПЭ и пигментированный эпителий цилиарного тела в условиях in vitro также способны проявлять некоторые свойства малодифференцированных клеток-предшественников.

При культивировании клеток РПЭ человека также была показана экспрессия пан-нейральных маркерных белков на фоне подавления исходных характеристик РПЭ. Также известно, что в условиях отслойки сетчатки у млекопитающих происходит инициация пролиферации отдельных ее клеточных типов. Так исследование включения 3Н-тимидина в отслоенной сетчатке кошки показало возможность синтеза ДНК для всех не нейральных клетках: макроглиальных клетках Мюллера, астроцитах, микроглиальных клетках и макрофагах сетчатки, а также в эндотелиальных клетках хороида (Fisher et al., 1991).

Для выявления восстановительных способностей сетчатки низших позвоночных модель отслойки сетчатки применяется редко. В немногочисленных работах исследована сборка и слущивание фоторецепторных дисков в зависимости от аппозиции сетчатки и РПЭ у Xenopus laevis, а также изменения глутаматэргической системы при отслойке сетчатки саламандры. Пролиферативной активности клеток сетчатки в условиях разобщения с РПЭ посвящена только одна работа, выполненная in vitro на тканях глаза эмбрионов шпорцевой лягушки, для решения вопроса о влиянии РПЭ на выход клеток сетчатки из пролиферативной фазы (Stiemke, Hollyfield, 1995).

В последние годы микрохирургическая отслойка сетчатки у тритонов оказалась удобной моделью in vivo для выявления обладающих потенциями к пролиферации клеток сетчатки у Urodela. Опыты с полной отслойкой сетчатки у тритона PI. waltl. показали, что у этих животных она остается жизнеспособной на всех сроках наблюдения (около двух месяцев). В результате Н-тимидиновой импульсной радиоавтографии на полутонких серийных срезах в разные сроки после отслойки удавалось выявить несколько типов клеток, включающих меченый предшественник синтеза ДНК. В S-фазе были обнаружены клетки ростовой зоны глаза, макро- и микроглии, а также отдельные клетки витреального ряда слоя интернейронов. Поскольку число обнаруженных в этом исследовании ДНК-синтезирующих клеток было невелико, работа нуждалась в дополнительных экспериментах с применением иных маркеров синтеза ДНК и использованием длительной непрерывной доставки предшественника.

В сетчатке глаза взрослых крыс также были идентифицированы клетки, способные к пролиферации и фенотипическим модуляциям. Исследования in vivo при повреждении с помощью нейротоксинов показали, что роль потенциального источника для регенерации может принадлежать клеткам Мюллера. Они входят в пролиферативную фазу, дедифференцируются, коэкспрессируют маркерный белок прогениторных клеток - нестин, и специфический белок глиальных клеток - GFAP, а затем, в определенных условиях, белки фоторецепторов и биполяров. Последнее и стало свидетельством продукции глиальными клетками Мюллера в зрелой сетчатке немногочисленных нейронов de novo.

В 2007 г. было также показано, что in vitro клетки Мюллера склонны к образованию сфероидов, где экспрессируются специфический для глиальных клеток ретинальальдегид (CRALBP), связывающий белок, GFAP и нестин. Несмотря на эти и другие находки в области исследования скрытых регенераторных возможностей сетчатки взрослых позвоночных и человека, эта работа еще далека от завершения. В частности, в данном аспекте не проводилось сравнение сетчаток низших и высших позвоночных, культивированных в сходных условиях in vitro.

Клеточное культивирование in vitro нейронов ЦНС, и в частности сетчатки, является сложным экспериментальным подходом. В последнее время растет число работ, где используется органотипическое культивирование изолированной сетчатки взрослых низших (Kustermann et al., 2008) и высших позвоночных животных (Koizumi et al., 2007; Fernandez-Bueno et al., 2008; Johnson, Martin, 2008; Kaempf et al, 2008). Эти исследования выполнены с различными целями, однако ни одно не связано с изучением в сетчатке клеток, являющихся источником для ее восстановления.

3D органотипическое длительное культивирование позволяет не только следить за реконструкцией сетчатки, но и обнаружить популяции пролиферирующих и дедифференцированных клеток. В результате возникло предположение, что при таком способе культивирования "молчащие" клетки-предшественники могут быть стимулированы к делениям, а в дальнейшем, при направленном воздействии, и развитию в нейрональном направлении. Это дало бы возможность накапливать клетки для восполнения нейронов, утраченных в результате повреждения или заболеваний сетчатки.

Для ответа на другой вопрос, а именно, почему потенции ретинального пигментного эпителия (РПЭ) к трансдифференцировке в клетки сетчатки у низших и высших позвоночных проявляются в различной степени, необходимо получить модели in vivo-like in vitro, позволяющие культивирование РПЭ разных животных в сходных условиях. 

В 2010 г. проведено длительное органотипическое 3D культивирование целой сетчатки и РПЭ, полученных из глаз позвоночных животных разных классов (тритон и крыса). С применением иммунохимических маркеров пролиферирующих клеток и клеточных фенотипов доказано участие глиальных клеток (тритон и крыса), клеток ростовой зоны и минорных популяций в ядерных слоях (тритон) и гистиоцитов (крыса) в восстановлении/реконструкции сетчатки in vitro. Для тритона понижение уровня дифференцировки названных клеточных популяций in vitro впервые подтверждено при использовании молекулярных маркеров (ENTPDase, нуклеостемин, тубулин). У этих животных также впервые описан способ реконструкции/регенерации сетчатки за счет клеточного замещения в ее структуре без участия РПЭ. Показана возможность усиления выявленных регенерационных ответов в сетчатке тритона с помощью антиоксиданта SkQl, предотвращающего гибель пролиферирующих и вновь образующихся дедифференцированных клеток. В изолированной сетчатке взрослой крысы обнаружены митотические деления глиальных клеток и резидентных моноцитов, а также активная транслокация тел нейронов - ответов, расцененных как способность к реконструкции. В целом данные свидетельствуют о том, что в сетчатке позвоночных в условиях 3D культивирования происходит активация клеток, способных к делениям и трансформации фенотипа, а также молекулярных механизмов, ответственных за процесс понижения уровня клеточной дифференцировки.

При тех же способах анализа проведено сравнительное исследование ретинального пигментного эпителия (РПЭ) в составе задней стенки глаза взрослых тритонов и крыс. Выяснено, что поведение клеток РПЭ животных с полярными возможностями для регенерации in vivo (тритон и крыса), in vitro имеет некоторые сходства. У обоих видов они обладают ДНК-синтезирующей активностью, но редко входят в митотическую фазу, а, вымещаясь, приобретают макрофагальный фенотип. Клетки в слое РПЭ удерживают исходную морфологию, но при этом часть из них экспрессирует пан-нейральные белки (NF-200, vimentin).

Отличие клеток РПЭ тритона от таковых крысы выражается в его способности формировать in vitro ряды дедифференцированных NF-200+ клеток. Об изменении дифференцировки этих клеток в сторону понижения свидетельствует также выявленная с помощью ПЦР экспрессия гена нуклеостемина. Добавление в среду FGF2 усиливает пролиферацию и процесс дедифференцировки. В целом данные говорят о том, что РПЭ взрослых тритона и крысы сохраняет потенции к проявлению черт нейральных клеток предшественников, однако более глубокие изменения по пути ретинальной дифференцировки присущи только РПЭ тритона, где FGF2 является одним из основных регуляторов. Также при введении в среду культивирования РПЭ крысы антиоксиданта SkQl происходит существенное снижение, как клеточной гибели, так и проявления патологических изменений РПЭ, а именно его трансформации в макрофагальный фенотип.

Пренатальное развитие сетчатки

Изучение молекулярно-генетических механизмов пролиферации и дифференцировки клеток в ходе развития сетчатки человека представляет одну из фундаментальных проблем биологии развития и регенерационной медицины. Нарушения в работе генной сети, контролирующей клеточные процессы, лежат в основе большого числа врожденных аномалий развития глаза и патологий, затрагивающих сетчатку. Исследования экспрессии генов в развивающейся сетчатке человека являются базой для изучения репаративных возможностей сетчатки.

При повреждении сетчатки у высших позвоночных, в том числе у человека, начинаются пролиферативные процессы, которые не приводят к ее восстановлению и часто являются причиной возникновения патологий. В эмбриональном и взрослом глазу человека, в том числе в сетчатке, обнаружены клетки, по своим свойствам соответствующие стволовым. Прогресс в исследованиях молекулярных механизмов контроля клеточных процессов в ходе развития сетчатки, находится в неразрывной связи с поиском генов-регуляторов, которые могут быть маркерами, позволяющих локализовать малодифференцированные (прогениторные) клетки сетчатки, что важно для изучения ее регенерационных потенций. В связи с этим, представляет интерес исследование характераэкспрессии гена нуклеостемина (GNL3), кодирующего GTP-связывающий белок, который связан с ядерными механизмами контроля. Нуклеостемин участвует в обеспечении стабильности архитектуры ядра, биогенезе рибосом, в функционировании теломеразного комплекса в процессе деления клетки, в регуляции пролиферации клеток.

Высокий уровень экспрессии нуклеостемина был обнаружен в эмбриональных и нейральных стволовых клетках, в некоторых линиях раковых клеток млекопитающих, а также обнаружена экспрессия нуклеостемина в прогениторных клетках (нейробластах) раннего зачатка регенерирующей сетчатки пока взрослого тритона. Полученные результаты и данные литературы позволяют отнести нуклеостемин к группе генов-маркеров пролиферирующих и малодифференцированных клеток.

Экспрессия нуклеостемина в ходе развития сетчатки человека

С помощью метода ПЦР мРНК нуклеостемина была выявлена в сетчатке, с 11.5 по 26 неделю развития. На 11.5-12.5 неделе развития, с использованием метода иммунохимии, нуклеостемин был обнаружен практически во всех клетках сетчатки. Сетчатка на этих стадиях развития представлена двумя нейробластическими слоями - источниками формирования всех типов клеток сетчатки. На данной стадии развития, иммуноспецифический сигнал обнаруживается в сетчатке виде дискретных скоплений в ядрышках, нуклеоплазме прогениторных клеток.

На 22 неделе пренатального развития область локализации нуклеостемина значительно сужается: белок преимущественно детектируется в клетках ганглиозного слоя сетчатки, а также в отдельных клетках внутреннего ядерного слоя, дифференцировка которых еще продолжается. На этой стадии иммуноспецифическии сигнал был обнаружен в ядрышках и нуклеоплазме.

К 31 неделе пренатального развития дифференцировка всех типов клеток сетчатки близка к завершению. При сохранении специфичности экспрессии нуклеостемина, на поздней стадии развития наблюдается снижение числа нуклеостемин-позитивных клеток. Таким образом, на поздних стадиях формирования сетчатки, экспрессия нуклеостемина сохраняется лишь в отдельных клетках сетчатки, что согласуется с данными о наличии в этой структуре глаза прогениторных клеток, по крайней мере, до 31 недели пренатального развития. Представляет интерес тот факт, что по мере дифференцировки клеток происходит не только сужение области локализации нуклеостемина и ее смещение во внутренние слои сетчатки, но также изменение внутриядерной локализации нуклеостемина. На поздних стадиях развития сетчатки нуклеостемин локализуется главным образом на ядерной мембране, хотя в единичных клетках детектируется и в ядрышках, и в нуклеоплазме.

Экспрессия нуклеостемина на стадии нейробластических слоев практически во всех клетках развивающейся сетчатки может отражать его участие не только в контроле пролиферации клеток, но и в регуляции специфических синтезов. Данные о локализации нуклеостемина в развивающейся сетчатке человека в дифференцированных ганглиозных клетках и в клетках внутреннего ядерного слоя, на пути к терминальной дифференцировке, также свидетельствуют о том, что функция нуклеостемина в этой ткани глаза не ограничивается участием лишь в контроле пролиферации клеток. Локализация нуклеостемина на поздних стадиях дифференцировки клеток сетчатки человека сходна с таковой в дифференцированных клетках регенерирующей сетчатки тритона. Обнаруженная экспрессия нуклеостемина в отдельных клетках внутреннего ядерного слоя сетчатки человека на поздних стадиях пренатального развития свидетельствует о наличии популяции прогениторных клеток, которые могут рассматриваться как регенерационный резерв для восстановления сетчатки. Полученные данные являются базой для дальнейших исследований.