Конфокальная микроскопия была разработана для изучения живых клеток с высокой точностью. В отличие от обычного светового микроскопа, она позволяет получать чёткие изображения конкретного слоя образца, исключая размытый фон. Это достигается за счёт того, что световой пучок сильно сужается с помощью специальных отверстий (диафрагм) или лазера, а также благодаря высокой разрешающей способности объектива. Благодаря развитию оптических технологий и лазеров во второй половине XX века, конфокальная микроскопия стала мощным инструментом для детального изучения структуры клеток и тканей.
Конфокальная микроскопия переднего сегмента глаза нашла широкое применение в офтальмологии, прежде всего для оценки состояния роговицы у пациентов с дистрофиями роговицы, кератоконусом, кератитами, офтальмомикозами, а также для оценки состояния после офтальмологических операций, таких как LASIK или имплантация колец при кератоконусе. Метод позволяет диагностировать заболевание уже на самых ранних стадиях заболевания. Этот метод позволяет врачам увидеть структуру роговицы на клеточном уровне без необходимости брать биопсию или проводить инвазивные процедуры.
Конфокальная микроскопическая картина нормальной стромы включает несколько ярких неправильной овальной формы тел, которые являются ядрами кератоцитов и лежат в толще прозрачного бесклеточного матрикса. Строма условно разделяется на субслои: передний (непосредственно под боуменовой мембраной), средний и задний. Плотность клеток уменьшается от передней к задней части стромы.
С помощью конфокальной микроскопии также возможно прижизненное изучение нервных волокон роговицы. Современные приборы позволяют проводить реконструкцию хода нервов, их количественный подсчет и качественный анализ. Это полезно например у пациентов с кератоконусом, так как нервные волокна в передних и средних слоях стромы визуализируются в виде извитых, увеличенных в диаметре структур, нередко с Y-образными бифуркациями.
Также у пациентов с кератоконусом II и III стадии изменена структура слоев роговицы, нарушена морфология клеток и архитектоника коллагеновых фибрилл. Наибольшую выраженность эти изменения имеют в переднем эпителии, строме и эндотелии в зонах истончения роговицы. Морфологические изменения лежат в основе оптической неоднородности ткани роговицы, изменения ее толщины, искажений преломляющей способности. Методика конфокальной микроскопии, применяемая для диагностики и мониторинга кератоконуса, позволяет оценить состояние тканей роговицы, структурных элементов клеток и межклеточного матрикса.
Конфокальный микроскоп отличается от "классического" оптического микроскопа тем, что в каждый момент времени регистрируется изображение одной точки объекта, а полноценное изображение строится путем сканирования (движения образца или перестройки оптической системы). Для того чтобы регистрировать свет только от одной точки после объективной линзы располагается диафрагма малого размера таким образом, что свет, испускаемый анализируемой точкой, проходил через диафрагму и был зарегистрирован, а свет от остальных точек в основном задерживался диафрагмой.
Существует несколько типов конфокальных микроскопов, используемых сегодня, – тандемно-сканирующие, щелевые и лазерные. В настоящее время чаще используют конфокальный микроскоп со щелевыми полевыми диафрагмами – «Confoscan 4» японской фирмы Nidek, имеющий разрешающую способность 1 мкм. Некоторые преимущества в сравнении с ним имеет аппарат компании Heidelberg Engineering – лазерный конфокальный микроскоп для переднего и заднего отдела – «Heidelberg Retinal Tomograph» (HRT). Корнеальный модуль этого прибора – «Rostock Cornea Module» (RCM), в отличие от других аппаратов, дает возможность исследовать не только центральную зону роговицы, но и все поверхностные структуры, а также передний сегмент глаза
Пример заключения о проведенном исследовании:
Под местной капельной анестезией Sol.Инокаин 0.5% в оба глаза проведено исследование структурно-клеточного строения роговицы (с использованием глазного геля Видисик).
Выявлено: OU Стушеванность границ клеток поверхностного эпителия, клетки промежуточного эпителия : ОD обычной формы и размера, OS на уровне слоя промежуточного и базального эпителия зафиксированы гиперрефлективные очаги (мелкие округлые и укрупненные зоны гиперрефлективности без четких границ) и в виде линий - очаги редупликации базальной мембраны эпителия . Базальный слой - ОD с локальным скоплением дендритных клеток, OS с депозитами и вышеописанными очагами. Боуменовый слой ОD слабо / OS умеренно локально неравномерно уплотнен. Нервы суббазального нервного сплетения истончены, ОD уменьшено их количество, имеют прерывистый ход, в слое локально дендритные клетки, OS истончены, умеренно снижена плотность, клетки Лангерганса единичны. В строме умеренная иррегулярность распределения ядер OD>OS . В эндотелиальном слое отмечается умеренно полимегатизм и плеоморфизм. Зафиксированы вакуолизированные клетки: ОD единичные, OS разрозненные и малыми группками. OU ПЭК в норме.
Заключение: КМ-признаки ОD эпителиопатии на фоне ССГ. Признаки лазерной кераторефракционной операци. КМ-признаки OS очагов редупликации базальной мембраны эпителия (по анамнезу посттравматические). OU на эндотелии зафиксированы разрозненные вакуолеобразные клетки, по количеству: OS (мало) > OD (единичные).
